Artikkelikuva: vasen Leica THUNDER, oikea tavallinen widefield mikroskooppi. Human Pluripotent Stem Cell (hPSC) derived neurons; Rabbit anti-vimentin+AF488, Chicken anti-MAP2+AF647 and Prolong Glass+NucBlue. Sample courtesy of Outi Paloheimo Tampere University.
Mikroskooppien perimmäinen toimintaperiaate on pysynyt jo vuosisatojen ajan käytännössä samankaltaisena: näytettä valaistaan tietynlaisella valonlähteellä näytteentarkasteluun sopivalla tavalla ja erilaisia linssisarjoja käyttäen näytteestä luodaan vaikkapa 1000-kertaisesti suurennettu kuva katselijalle. Toki kehitystä on tapahtunut paljon sekä linssien, että itse kuvantamislaitteistojen toiminnallisuuden saralla: nykyaikaiset mikroskooppijärjestelmäthän ovat hyvin monipuolisia työasemia, joissa jopa kaikki työskentely tapahtuu tietokoneella napsutellen. Mikroskoopit ovat täysin automatisoituja ja kaikkia toimintoja voidaan ohjata suoraan työasemalta. Tutkija antaa käskyt ja laitteisto hoitaa työn, kuten vaikkapa useita päiviä kestävän solujen kehityksen seurannan 384-kuoppalevyn jokaiselta kuopalta useilla fluoresenssikanavilla ja läpivalokontrastointimenetelmillä. Data voidaan siirtää suoraan analyysiohjelmaan, jossa voidaan automatisoidusti määrittää vaikkapa solujen elinkykyä tai liikkuvuutta.
Leica THUNDER – Laskennallinen kuvanpuhdistus
Valo rajoittaa valomikroskopiaa
Valomikroskopia on erinomainen ja muovautuva työkalu hyvin monipuolisiin kuvantamistarpeisiin sekä biologisilla että ”epäorgaanisilla” tieteenaloilla. Silläkin on kuitenkin omat rajoitteensa. Yksi rajoittava tekijä on itse valo ja sen diffraktion asettama raja, ns. Abbe Limit. Näkyvän valon aallonpituus asettaa valomikroskoopeille erotuskyvyn rajaksi yleisesti n. 200 nm. Tämä maaginen raja on toki onnistuttu ohittamaan useiden erilaisten lähestymistapojen avulla, kuten vaikkapa STED (Stimulated Emission Depletion), GSD/dSTORM (Ground State Depletion, Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) tai vaikkapa TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) -tekniikoiden avulla.
Toinen rajoittava tekijä widefield mikroskopiassa (eli kun kuvaamisen käytetään kameraa) on tarkennustason ulkopuolelta tuleva valo. Kun suurennosta kasvatetaan, myös fokussyvyys kapenee, ja sitä enemmän kuvassa näkyy valoa myös tarkennusalueiden ulkopuolelta. Tämä luo kuvaan tietynlaisen ”udun”, joka häiritsee pahimmillaan hyvin voimakkaasti tarkastelun kohteena olevan tason yksityiskohtien havaitsemista. Yleisesti ottaen voitaisiin todeta, että mitä paksumpi näyte, sitä enemmän hajavaloa kuvaan tulee. Tähän kehitetty yleisesti tunnettu lääke on konfokaalimikroskopia, jossa hyödynnetään ”neulansilmä” -rakennetta (pinhole) ja lasereita. Teknologian avulla detektoreille voidaan kerätä vain tarkennusalueelta emittoitu valo, ja näin ollen voidaan luoda selkeitä kuvia kustakin fokustasosta, ja tavallista valomikroskopiaa tarkempi kolmiulotteinen malli vaikkapa yksittäisestä solusta ja sen sisäisistä rakenteistakin.
Uudelle tasolle tietoteknisillä oivalluksilla
Viimeaikojen suurimmat harppaukset mikroskopian saralla lienee otettu tietoteknisten työkalujen ja kuvankäsittelyn hyödyntämisessä. Vuonna 2019 Leica Microsystems toi markkinoille uuden mullistavan THUNDER teknologiansa. THUNDER on Leica Microsystemsin kehittämä opto-digitaalinen kuvanpuhdistusmenetelmä, joka pyrkii laskennallisin keinoin saavuttamaan samankaltaista lopputulosta, kuin mihin konfokaalimikroskooppien avulla halutaan päästä: eroon tarkennusalueen ulkopuolelta tulevasta valosta.
Konfokaalimikroskopiassa on toki omat kiistattomat etunsa, joita voidaan saavuttaa juuri esimerkiksi laserien ja neulansilmärakenteiden avulla, mutta THUNDER -teknologia tuo pöytään joitakin ohittamattomia lisäavuja: nopeuden, helppouden ja edullisuuden.
Nopeus
THUNDER-teknologian ehdoton valttikortti on nopeus! Kuvantaminen on yhtä nopeaa kuin Widefield -laitteistoilla yleensäkin, sillä havainnointi tapahtuu kameralla. Instant Computational Clearing (ICC) toimii reaaliajassa, ja tuottaa välittömästi laskennallisesti puhdistetun kuvan tasosta. Kun tähän yhdistetään Leican erittäin innovatiivinen Synapse -triggeröinti, kuvausnopeus nousee päätähuimaaaksi: nopeimpienkin solutapahtumien detektointi onnistuu.
Images courtesy of Dr. Ralf Jacob, University of Marburg, Germany
The two videos here show MDCK cells expressing mx1-GFP before, and after THUNDER Instant Computational Clearing. By using THUNDER, the mx1 protein expression became much more identifiable, and could be ablated with the Infinity Scanner.
Helppous
THUNDER laitteistot ovat aivan yhtä yksinkertaisia ja helppoja käyttää kuin mitkä tahansa muutkin Widefield mikroskooppijärjestelmät. Kuvanpuhdistuksen voi tehdä joko kuvia otettaessa tai myös jälkikäsittelynä. Raakadata säilyy aina! Jos kuvanpuhdistuksen haluaa kytkeä päälle, se onnistuu nappia painamalla eikä vaadi suuria esisäätötoimenpiteitä käyttäjältä. Kaiken tämän päälle Leican LAS X ohjelma on erittäin intuitiivinen, helposti ymmärrettävissä ja nopeasti opittavissa. Navigator työkalu mahdollistaa nopeiden yleissilmäysten luomisen näytteisiin ja esimerkiksi koeasetelmien luominen kuoppalevyformaattiin on erittäin helppoa. Suositut asetukset voi tallentaa valmiiksi pohjiksi ja niihin on erittäin helppo palata.
Edullisuus
Yleisesti ottaen on totuttu, että konfokaalimikroskoopit ovat ns. kuvantamisyksiköiden työkaluja, niiden käyttö vaatii suurta ammattitaitoa ja ne ovat kalliita hankkia. THUNDER laitteisto on hinnaltaan konfokaalimikroskooppia edullisempi, kyeten kuitenkin tarjoamaan kyseisten instrumenttien kuvanlaatua lähestyvän tason, joka on useimpiin sovelluksiin varsin riittävä. Tutkijat säästävät paljon aikaa, kun ei tarvitse aina varata sopivaa aikaa kuvantamisyksikön konfokaalimikroskoopeilta ja lisäksi käytön oppiminen ja opettaminen on nopeaa ja helppoa. Yksittäisen tutkimusryhmän budjetin tasolla tarjolla oleva laite, joka kykenee suoriutumaan monipuolisesti erilaisista kuvantamistehtävistä säästäen tutkijoille sekä aikaa että rahaa, onkin osoittautunut varsin suosituksi vaihtoehdoksi sekä Suomessa että maailmalla.
Lue lisää THUNDER-malleista ja siitä miten THUNDER-laitteistot toimivat: täältä!
Minne mikroskopia on matkalla?
Mikroskopian tulevaisuuden suuri kehityskenttä tulevaisuudessa (ja jo tälläkin hetkellä) lienee tekoälyyn ja kone-/syväoppimiseen pohjautuvat teknologiat. Linssien ja valon avulla taiteilemalla ollaan jo hyvin pitkälti saavutettu se, mitä saavutettavissa on, mutta tietotekniikan ja tietokoneiden kasvavan laskentatehon ja älykkäiden ratkaisujen alueilla on vielä paljon kartoittamattomia vesiä. Nykyisillä kuvantamisen työkaluilla on erittäin helppo tuottaa valtavia määriä kuvamateriaalia, mutta haasteeksi nouseekin usein analysointi ja laskentakapasiteetti. Kuinka erotella ulos luotettavasti ja toistettavasti juuri se tärkein ydintieto valtavista datamassoista?
Tulevaisuuden kuvantamislaitteistoissa tutkijalla lienevät apunaan ”toiset tekoälyaivot”, jotka hikoilevat väsymättä kuva-analyysityötä yhdessä tutkijan kanssa kohti asetettuja tavoitteita. Tekoäly oppii yhä viisaammaksi ja sujuvammaksi työn edetessä ja pystyy tarjoamaan tutkijalle yhä nopeammin ja tarkemmin ratkaisuja ja päätelmiä pohjaten valtaviin data-aineistoihin, joita nykyisetkin kuvantamislaitteistot kykenevät tuottamaan.
Kaiken ytimessä on ensiluokkaisen laadukas, erotuskykyinen ja luotettava kuvamateriaali, jota voidaan käyttää tehokkaasti analyysien lähtöaineistona. Tällaista optisen kuvantamisen edelläkävijä, Leica Microsystems, kykenee tuottamaan nyt ja tulevaisuudessa.