tauSTED – Nanoskopian keihäänkärki
STED -mikroskopia on nopein tapa kuvantaa valon difraktiorajan tuolla puolen. STED:ssä hyödynnetään kahta laseria: toista käytetään fluoresoivan merkkiaineen jännittämiseen ja toinen toimii ns. depleetio (ns. ehdyttävänä tai ”vaimentavana”) laserina. Näiden kahden laserin yhteistoiminnalla voidaan saavuttaa valomikroskopian mittakaavassa hyvin korkeita erotuskykyjä. STED teknologian kehittäjä Stefan Hellille on myönnetty jaettu Nobel -palkinto kyseisestä teknologiasta ja työstä valomikroskopian resoluutiorajojen murtamisesta.
Leican STED teknologiassa hyödynnetään myös fluoresenssin elinikä -informaatiota. tauSTED:ssä voidaan STED-prosessin seurauksena syntyvät fotonit erotella elinikänsä mukaan. Tämän seurauksena saavutetaan vielä tavanomaistakin STEDiä korkeampi erotuskyky (<30 nm), mutta ei ole tarpeen käyttää yhtä korkeita ”valoannoksia”.
tauSTEDin avulla voidaan saavuttaa samalla laserin intensiteetillä korkeampi erotuskyky tai vastaavasti pienentää laserin tehoa, koska elinikätiedon avulla erotuskykyä voidaan edelleen parantaa. Näin ollen tauSTED soveltuu esimerkiksi hyvin nopeutta ja hellävaraisuutta vaativaan elävien näytteiden korkean resoluution (nanoskopia) kuvantamiseen, koska näytettä voidaan tarvittaessa skannata erittäin nopeasti käyttäen resonanssiskanneria (esimerkiksi 28 fps 512×512 8kHZ tai 40fps 512×512 12 kHz) pitäen kuitenkin valoannoksen näytteelle minimaalisena.
STED-mikroskopian ohella Leica STELLARIS 8 STED konfokaalimikroskooppi palvelee laajaa käyttäjäkuntaa myös erittäin joustavana ja monipuolisena konfokaalimikroskooppina: esimerkiksi valkoisen valon laserin, herkkien HyD detektorien ja tau -työkalujen hyödyt ovat kiistattomat ja helposti jokaisen käyttäjän ulottuvilla!
Kuva 1. STED for Cell Biology: TauSTED 660 reveals the distribution of nuclear pores (NPCs) on COS7 cells immunostained for Nup complexes with AF555. Only 2% of STED light reveals much more detail. The primary antibody mAb414 recognizes several nucleoporins of the pore basket and produces a punctate-like staining.
STED for Cell Biology: Gentle live-cell TauSTED 592 on cells stably expressing LifeAct-mNeonGreen. Scale bar: 5 µm. The time-lapse imaging here shows 230 frames @1 fps. Sample courtesy of Max Heydasch, University of Bern, Switzerland.
Kuva 2. STED for Microbiology: Bacterial flagella visualized with correlative three-color confocal-LIGHTNING-STED imaging which enables the investigation and validation of samples using complementary approaches. Sample courtesy of Marc Erhardt, Humboldt-Universität, Berlin, Germany.
Kuva 3. STED-FLIM for Cell Biology: STED 775 and FALCON automated phasor separation allow separating species with overlapping spectra using their fluorescence lifetime. In HEK cells labeled for vimentin and actin, the photon counts intensity information alone (gray) shows both structures as indistinct, while they are clearly distinguished with STED-FLIM (green, Vimentin AF647; magenta, Actin ATTO 647N-phalloidin). Scale bar: 4 µm. Sample Courtesy of Sebastian Hänsch, Stephanie Weidtkamp-Peters, CAI, Düsseldorf, Germany.
