Kuva 1. vasen: tavallinen fluoresenssimikroskooppikuva; oikea Leica THUNDER kuva jossa käytetty ICC- teknologiaa. Murine esophageal organoids. Integrin alpha6 (AlexaFluor 488, green), Sox2 (AlexaFluor 568, red), Nucleus (Dapi, blue). Sample courtesy of Dr. Fabio Tadeu Arroso Martins, Tampere University, Finland.
Leica THUNDER teknologia nostaa widefield epifluoresenssimikroskopian uudelle tasolle
Nopeus
THUNDER laitteistoilla hyödyt kamerapohjaisen kuvantamisen nopeudesta ja herkkyydestä. Näytteiden valotusajat jäävät lyhyiksi herkkien kameroiden ja huippuluokan optiikan ansiosta, ja näin teknologia on myöskin erittäin hellävarainen eläville näytteille! Tarvittaessa saavutetaan vaikka 100 fps:n kuvantamisnopeus, mikä mahdollistaa erittäin nopeiden solutapahtumien tallentamisen.
Helppous
Käyttö on yhtä helppoa kuin minkä tahansa muunkin Widefield mikroskooppilaitteiston. Leican LAS X ohjelmisto on erittäin intuitiivinen ja helppokäyttöinen ja Navigator työkalulla kuvaat laajat alueet ja vaikkapa kuoppalevyt helposti ja nopeasti.
Edullisuus
Laitteistot ovat konfokaalimikroskooppeja edullisemmassa hintaluokassa tarjoten erittäin korkealuokkaista kuvanlaatua, ja selkeämpiä ja tarkempia optisia leikkeitä ilman fokusalueiden ulkopuolelta tulevaa ”utua”.
Leica THUNDER Laitteistot
Leica Microsystemsin THUNDER-teknologia on täysin valmistajan itsekehittämä työkalu widefield mikroskopiaan. THUNDER laitteistot tulevat tietynlaisina mikroskooppikokonaisuuksina, joista valitaan omaan työskentelyyn soveltuva malli. Jos kuvaa esimerkiksi lähes yksinomaan leikelaseja (kudosleikkeet tms. näytelasiformaatissa olevat näytteet, voisi sopiva työkalu olla esimerkiksi THUNDER 3D Tissue Imager, joka rakentuu Leica DM6 täysautomaattisen upright (objektiivit näytteen yläpuolella) mikroskoopin ympärille. Toki laseja voidaan yhtä hyvin kuvata myös käänteismikroskoopilla (objektiivit näytteen alapuolella). Tämä rakenne mahdollistaa toki myös monipuolisemmin myös muunlaisten näyteformaattien käytön (kuten petrimaljat, kammiolasit, kuoppalevyt jne.). Leica DMi8 käänteismikroskooppiin pohjaavat THUNDER -mallit ovat 3D Assay, 3D Cell Culture ja 3D Live Cell, jotka eroavat hiukan lähtökohtaiselta varustelutasoltaan.
Mielenkiintoinen lisä THUNDER valikoimaan on myös THUNDER Imager Model Organism -malli, joka rakentuu LeicaM205 FCA tai FA fluoresenssistereomikroskooppimallin ympärille. Kuten nimestäkin jo huomaa, laitteisto on suunnattu erityisesti hiukan makroskooppisempien näytteiden kuten tiettyjen malliorganismien (seeprakalat, sukkulamadot, banaanikärpäset jne) kuvantamistarpeisiin. Laitteistolla kuitenkin päästään hyvinkin kuvantamaan yksittäisen solunkin tasolla käyttäen Leican FluoCombi ominaisuutta!
Miten ne THUNDER -laitteistot sitten toimivat?
Taustan poistoon on olemassa erilaisia laskennallisia lähestymistapoja, kuten esimerkiksi vaikkapa rolling ball ja sliding paraboloid -menetelmät. THUNDER laitteiden ytimessä on ns. Instant Computational Clearing (ICC) lähestymistapa, jossa laskennallisesti poistetaan fokusalueiden ulkopuolelta tuleva signaali. Kaikkien menetelmien tarkoituksena on kuitenkin vähentää kohinaa ja taustaa, kuitenkin säilyttäen luotettavasti näytteen yksityiskohdat. Kun kuvasta saadaan puhdistettua tarkka ja selkeästi erottuva, myös kuva-analyysi ja kvantifiointi helpottuvat.
ICC:n erottaa muista menetelmistä sen helppokäyttöisyys ja integraatio suoraan kuvantamisen työnkulkuun. Teknologian käyttöönotto ei vaadi vaivalloista jälkiprosessointia tai optimointia, vaan se on aktivoitavissa reaaliajassa yhdellä hiiren napsautuksella. Rolling Ball, Sliding Paraboloid ja muut taustan poistomenetelmät vaativat esimerkiksi PSF:n (point-spread-function) mallintamista, tiettyjen rakenteellisten elementtien tai wavelettien käyttöä. Näiden parametrien tunnistaminen ja optimointi mahdollisimman korkealuokkaisen tuloksen saavuttamiseksi vaatii aikaa ja perehtyneisyyttä, ja työ on usein hyvin manuaalista. Kaikilla menetelmillä voidaan pohjimmiltaan saavuttaa samanlaisia tuloksia widefield kuvien taustan poistossa (lue lisää Technical Brief:stä), mutta Leica THUNDERin ICC -menetelmän lähestymistapa on nopeampi ja vaivattomampi säilyttäen myös aina lähtöaineiston.
Huomioitavaa on, että mikään näistä taustanpoistomenetelmistä eivät paranna erotuskykyä, vaikkakin yksityiskohdat toki kontrastoituvat paremmin esiin puhdistuksen ansiosta. Leica THUNDER laitteistojen ICC voidaan yhdistää lisäksi Leica Microsystemsin kehittämään adaptiiviseen dekonvoluutioon, joka tarjoaa kontrastin parantamisen ohella myöskin parannuksen erotuskykyyn! Kun ICC:n lisäksi käytetään adaptiivista dekonvoluutiota, kutsutaan lähestymistapaa (valitusta metodista riippuen), joko Large tai Small Volume Computational Clearingiksi (LVCC, SVCC). Nämäkin työkalut kuuluvat aina osaksi Leica THUNDER laitteistopakettia, ja ovat täysin integroidut laitteistojen työnkulkuihin eli niitä voidaan käyttää sekä reaaliajassa että jälkikäsittelynä.
Teknologiasta löytyy yksityiskohtaisempia tietoja täältä:
- https://www.leica-microsystems.com/science-lab/thunder-technology-note/
- https://www.leica-microsystems.com/science-lab/an-introduction-to-computational-clearing/
- https://www.leica-microsystems.com/the-power-of-pairing-adaptive-deconvolution-with-computational-clearing/
Leica THUNDER – Laskennallinen kuvanpuhdistus paljastaa sumussa piilottelevan näytteen. Lue blogista lisää!
